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流式检测细胞凋亡还有哪些方法?

前面讲到使用流式细胞术进行细胞凋亡检测的annexinV/PI双染色法,今日首要扼要介绍SYTO/PI双染色法、细胞DNA含量剖析法、TUNEL法。

SYTO/PI双染色法

SYTO系列染料是一种细胞膜通透性的核酸染料,可以自在进入活细胞与细胞内的DNA或许RNA结合,未结合时发射荧光信号的才干很弱,与核酸结合后发射荧光信号的才干大幅度升高。依据SYTO发射荧光信号波长的不同,首要可以分为蓝、绿、橙和红四大类。

用SYTO染料符号细胞后,尤其是与PI染料一起符号时可以差异活细胞、凋亡细胞和坏死细胞,因而其最首要的使用便是检测细胞凋亡,其间最具有代表性的是SYTO11、SYTO16、SYTO17和SYTO62等。

SYTO与活细胞的核酸结合得最多,所以用SYTO符号细胞时,活细胞SYTO发射的荧光信号最强,SYTO与凋亡细胞核酸结合的才干大幅度削弱,与坏死细胞核酸结合的才干最低,所以SYTO染料可以用于辨别活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。

SYTO染料结合凋亡细胞核酸的才干削弱的切当机制现在没有清晰,可能与细胞凋亡时染色质固缩导致SYTO结合位点削减以及RNA降解等有关。

SYTO/PI双染色法检测细胞凋亡的办法十分简略,只需将SYTO染料和PI染料直接参加待测的单细胞悬液中,SYTO染料的符号终浓度为50nmol/L,PI染料的符号终浓度为5ug/ml,避光常温静置20min即可。SYTO11和SYTO16由488nm激光激起,FL1通道接纳荧光信号;SYTO17和SYTO62由633nm激光激起,APC通道接纳荧光信号。

下图所示的是用SYTO/PI双染色法检测细胞凋亡的流式图。活细胞、凋亡细胞和坏死细胞结合SYTO的才干顺次递减,PI是细胞膜非通透性染料,活细胞和凋亡细胞的细胞膜是完好的,不能被PI染料符号,而坏死细胞的细胞膜现已不完好,可以被PI染料符号。所以用SYTO/PI双染色时,活细胞表现为SYTOhighPI-,如图中右侧细胞群所示;凋亡细胞表现为SYTOdimPI-;坏死细胞表现为SYTOlowPI+。

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细胞DNA含量剖析法检测细胞凋亡

用PI染色法检测细胞内DNA含量也可以用于检测细胞凋亡。细胞凋亡时核酸内切酶被激活,细胞内的DNA广泛开裂,一方面在符号PI时有必要先用固定剂固定细胞使细胞膜的通透性添加,让PI染料可以经过细胞膜进入细胞内部与DNA结合,此刻凋亡细胞内开裂的DNA小碎片就可以经过细胞膜逸出细胞;另一方面凋亡细胞内的DNA小碎片也会降解。所以,凋亡细胞内的DNA含量比正常细胞少,在PI通道上检测到的荧光信号就会比正常二倍体DNA含量的荧光信号弱。

所以凋亡细胞会在DNA直方图二倍体峰的前面呈现一个DNA含量少于二倍体的亚二倍体峰,如下图所示。PI染色法检测细胞内DNA含量的办法后边还会有具体介绍。

尽管此法比较简略,也较为常用,可是这种办法的特异性并不是很高。由于亚二倍体峰的呈现并不是凋亡细胞所特有的,非整倍体细胞、机械损害的细胞也可以呈现这种亚二倍体峰。所以用此办法检测细胞凋亡时,应先用其他方能确认样品细胞内的确有凋亡细胞,而没有其他引起亚二倍体峰呈现的状况,再用此办法定量检测样品内凋亡细胞的份额。

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TUNEL法

TdT介导的dUTP缺口结尾符号法是20世纪90年代发展起来的检测细胞凋亡的办法,可用于白腊包埋安排切片和冰凉安排切片的免疫安排化学剖析和单细胞悬液的流式细胞术剖析。细胞凋亡时,核酸内切酶被活化,细胞内双链DNA上会呈现许多不对称的开裂点,此刻参加脱氧核苷酸结尾转移酶和荧光素偶联的dUTP,TdT可以催化荧光素偶联的dUTP连接到凋亡细胞DNA上的这些开裂点,而荧光素偶联的dUTP不能连接到活细胞内完好的DNA,流式剖析就可以差异凋亡细胞和正常活细胞。

TUNEL法检测细胞凋亡时需要将外源性的荧光素偶联的dUTP和TdT导入细胞内,而凋亡细胞和活细胞的细胞膜都是完好的,所以符号时首要要用固定剂固定细胞,然后用打孔剂在细胞上打孔,让荧光素偶联的dUTP和TdT进入细胞内才干完结符号进程。

TUNEL法不只可以辨认凋亡细胞中由核酸内切酶催化发生的DNA断点,并且可以辨认有丝分裂DNA仿制时发生的组成性生理性切断和组蛋白转录后润饰点,以及坏死细胞的随机DNA断点。因而,TUNEL法检测细胞凋亡的特异性并不高,无法差异凋亡细胞、有丝分裂的细胞和坏死细胞。


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